медицинский каталог




Эмбриональные стволовые клетки

Автор Репин В.С., Ржанинова А.А., Шаменков Д.А.

из бластоцисты обезьяны.

Качественные сдвиги в этой проблеме возникли в 1998 г после изолирования бессмертных линий ЭСК человека. Решающую роль сыграла компания Герон из Калифорнии, которая вложила в исследования Томсона и Герхарда 5 млн долларов. Государственные академические учреждения наложили мораторий на эти исследования. Этот вклад фирмы обернулся новой биологией. Изолирование ЭСК человека авторитетный журнал Science назвал третьим по важности открытием в биологии ХХ века (после открытия двойной спирали и программы «Геном человека»). С середины 90-х годов не прекращались попытки получения линий ЭСК человека в нескольких лабораториях США, Великобритании, Канады, Индии, Австралии/Синапура, Японии.

В 1998 г ин-т репродуктивной биологии в Норфолке (Канада) первым наладил производство бластоцист человека из банка спермы и яйцеклеток. На втором этапе бластоцисты использовались для выделения линий ЭСК человека. Однако канадцы не успели первыми изолировать линию ЭСК человека из «лабораторных» бластоцист.

В 1998 г Джеймс Томсон (Висконсинский ун-т, США) изолировал 5 линий ЭСК из замороженных бластоцист человека, оставшихся неиспользованными после суперовуляции и получения оплодотворенных яйцеклеток с целью получения беременности (Thomson J., Itskovitz-Eldor J, Shapiro S.S., 1998). Оригинальный метод получения ЭСК из бластоцисты человека изложен в знаменитом патенте 6.200.806, полученном в марте 2001 г Wisconsin Alumni Res Foundation (WARF). Патент частично продан фирме Geron на получение некоторых специализированных клеток человека (нейроны, кардиомиоциты, клетки печени, поджелудочной железы).

Рис 1-5 Устройство бластоцисты (А) - под ф/к микроскопом (Б) - ошаренные ППК на подложке из вытянутых клеток Сертоли (сканирующая электронная микроскопия)

Рис 1-6. Выделение ЭСК из бластоцисты человека

Зародыши обязательно замораживали перед выделением ЭСК. Известно, что после замораживания большинство зародышей теряли способность проходить без отклонений послеимплантационный период развития в матке (одно из требований биоэтики для использования «остатков» зародышей после операции искусственного оплодотворения). После размораживания в среде Дульбекко с помощью игл и микроманипулятора выделяли эмбриобласт, предварительно помеченный флуоресцентно мечеными антителами. Мелко нарезанную ткань эмбриобласта выращивали в той же среде Дульбекко 9-15 дней над облученным фидером фетальных фибробластов с добавлением трех ростовых цитокинов (LIF, IL-6, SCF). Клетки в культуре интенсивно делились, формируя множество новых клонов по периферии микроэксплантатов эмбриобласта. Эти выросшие по краям эксплантата однородные колонии аккуратно собирали и повторно диспергировали (но не до одноклеточной суспензии). В суспензии ЭСК росли клонами, которые вновь диссоциировали пипетированием. Максимальную скорость экспансии клонов достигали повторной диссоциацией агрегатов на стадии 10-15 клеток. Новые клоны возникали через 5-7 суток. Каждый клон переносили в микроячейку и выращивали до агрегата из 40-50 клеток. Процедуру повторяли в пассажах, увеличивая плотность до 6-10 миллионов на чашку Петри (6 см). Из клонов удалось выделить несколько ХХ и ХУ линий ЭСК человека, которые через 100-120 пассажей сохраняли высокий темп клеточных делений, высокую активность теломеразы, минимальный белковый фенотип, тотальную потентность генома. Незрелые ощаренные клетки в мелких интенсивно пролиферирующих клонах экспрессировали на поверхности общий гетеродимерный рецепор для LIF, SCF и IL-6. В присутствии указанных митогенов сигнал от рецептора передается через трансмембранную субъединицу GP-130 в ядро. Детали устройства и работы этого рецептора показаны на рис (Рис 1-9). Активная сигнализация через рецептор в ядре блокировала остановку клеток в G0 -фазе, стимулируя немедленную инициацию G1 - фазы.

Дифференцировка ЭСК начиналась (после смены среды, удаления фидера и LIF, добавления сыворотки) с прикрепления клеток к подложке и формирования цитоскелета. Ни одна из линий не являлась клоном, т.к. была получена не из одной клетки (а из кластера клеток). Рост клонов шел периферией. В фазу равновесия пролиферация прогениторных слоев уравнивалась апоптозом и миграцией клеток из клона. Рост клоногенной культуры определяли тремя параметрами: а) числом клонов/мл, б) долей клеток в клоне/общее число клеток в культуре, в) скоростью обновления клонов в культуре. Линии ЭСК в культуре формировали суспензионные клоны двух типов: а) плотные симметричные сферы, б) рыхло собранные уплощенные колонии. Компактные сферы были резистентны к трипсину и пипетированию, тогда как рыхлые неправильные колонии диспергировали на отдельные клетки, как трипсином, так и механически.

В отличие от ЭСК мыши, линии ЭСК человека для сохранения пролиферации без дифференцировки требовали фидерного слоя клеток и LIF одновременно. Без LIF и фидера ЭСК прикреплялись к подложке, делились и формировали монослой из продвинутых диференцированных клеток. Сохранение потенциала пролифе

страница 12
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66

Скачать книгу "Эмбриональные стволовые клетки" (12.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]


Химический каталог Rambler's Top100

Copyright © 2009
(16.02.2019)