медицинский каталог




Эмбриональные стволовые клетки

Автор Репин В.С., Ржанинова А.А., Шаменков Д.А.

рации и незрелого фенотипа не являются частью автоматики этих клеток, а требуют специальных условий для реализации. При малых плотностях культивирования добавляли bFGF или сыворотку для поддержания пролиферации. Появился метод длительного пассирования (250 пассажей в течение года) линии ЭСК человека без фидера на поверхности матригеля в среде, кондиционированной супернатантом от выращивания фетальных фибробластов (Xu C., Inokuma M.S., Denham J. et al., 2001). Благодаря матригелю, удавалось нарастить больше клонов в единице объема. Поверхность микрочастиц матригеля была покрыта ламинином. ЭСК с помощью рецептора к ламинину прикреплялись к поверхности микрочастиц и формировали клоны (ламининовый рецептор – единственный рецептор клеточной адгезии, экспонированный на поверхности ЭСК человека и тератокарциномы). Даже при добавлении кондиционной среды после выращивания фетальных фибробластов и LIF, скорость роста клонов ЭСК оставалась невысокой (на порядок ниже, чем у Томсона). Без добавления супернатанта от фидера клоны ЭСК быстро теряли Oct-4 и вступали в скрытую фазу дифференцировки. Одиночные клетки после прикрепления автоматически дифференцировались. Образование смешанной культуры из дифференцированных распластанных по гелю клеток и клонов ЭСК было вторым недостатком метода.

Линии ЭСК человека, трансплантированные в виде суспензии одиночных незрелых клеток, генерировали тератомы в тканях взрослых иммунодефицитных животных (Odorico J.S., Kaufman D.S., Thomson J.A., 2001).

В 1998 г Джон Герхарт (Ун-т Джона Гопкинса, Балтимор, США) впервые изолировал бессмертные линии половых прогениторных клеток (ППК) из полового зачатка фетусов 4-5 недели гестации. Через 2-3 недели половой зачаток человека необратимо изменялся, хотя фенотипически сохранял те же клетки. Однако выделить ППК в виде бессмертной линии из зародышей более поздних сроков пока никому не удалось. ППК возникают в желточном мешке на 3-й неделе развития. Эти экстраэмбриональные провизорные клоны через 1-2 недели мигрировали в зону половых бугорков зародыша, где формировали "дормантные" популяции прогениторных плюрипотентных клеток. Значительная часть ППК сохраняется без изменений в зародыше вплоть до рождения. С ППК работать легче, поскольку этой ткани в фетусе больше, чем клеток эмбриобласта (Shamblott M.J., Axelman J., Gaerhart J. et al., 1998). Технология получения ППК запатентована в 1998 г (патент 6245566 от 12 июня 2001 г). Пересадки аллогенных ППК уже используют для лечения мужского бесплодия, поскольку донорские клоны ППК хорошо встраиваются и колонизируют иммунопривиллегированные вакантные зоны эпителия канальцев (Shinohara T., Avarbok M.R., Brinster R.L.,1999; Shinohara T., Orwig K., Brinster R.L., 2001). Данный метод особенно важен для получения зародышей-трансгенных химер, которые переносят новый генетический вектор в половые клетки и обеспечивают вертикальную передачу нового гена потомству. Существенно и то, что с фетальной абортной тканью можно работать в исследовательских лабораториях. Изолированную ткань полового зачатка 4-5 недельных фетусов диспергировали до взвеси одиночных клеток с помощью смеси коллагеназы IV-V, гиалуронидазы и ДНКазы. Ферментативное отделение ППК от стромальных клеток Сертоли необходимо для активации пролиферации ППК. Клетки Сертоли синтезируют набор антимитогенов и специальных факторов, удерживающих ППК в неактивном «дормантном» состоянии (Рис 1-6-Б)

Первичную культуру ППК также выращивали над слоем фидера (первый-второй пассаж фетальных фибробластов). Для стимуляции пролиферации ППК в среду добавляли bFGF, LIF и форсколин (стимулятор уровня цАМФ). В культуру ППК добавляли также 15% фетальную сыворотку (HyClone). Преобладающая часть клеток размножалась суспензионными клонами.

На следующем этапе изолировали самые крупные интенсивно пролиферирующие колонии с множественными пузырьками (кистами). Возникающие клоны являются истинными первичными клонами (в отличие от эмбриоидных телец, которые являются вторичными агрегатами клеток, вступающими в фазу дифференцировки ). Активно пролиферирующие клоны составляли примерно 2-5 % клеток от всей клеточной массы ППК. Лишь малый процент первичных клонов сохранял высокий темп пролиферации клеток. Эта спонтанно растущая плюрипотентная ткань содержала одновременно нестин+, виментин+, GFAP+ клетки (варианты нейрональных стволовых клеток). Эти же клеточные массы содержали стволовые гематогенные, мышечные, мезенхимальные стволовые клетки, маркеры предшественников эндотелия, а также маркеры эндодермы. Одновременно многие клетки в составе этих агрегатов имели экспрессированные мРНК трех зародышевых листков и мезензимы (Schamblott M.J., Axelman J.,Littlefield J.W., et al., 2001). Выращенная плюрипотентная ткань на стадии появления маркеров региональных стволовых клеток имела две особенности. Во-первых, пересадки этой ткани SCID- мышам не давали опухолей (в отличие от линий ЭСК). Во-вторых, ткань содержала мощные пролиферирующие клоны, которые сохраняли высокий темп делений

страница 13
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66

Скачать книгу "Эмбриональные стволовые клетки" (12.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]


Химический каталог Rambler's Top100

Copyright © 2009
(11.12.2018)