медицинский каталог




Эмбриональные стволовые клетки

Автор Репин В.С., Ржанинова А.А., Шаменков Д.А.

, глии ( более сложно получить олигодендроциты), чем превратить эмбриоидные тельца в нейросферы ( Okabe S., Forssberg-Nilsson K., Spiro A.C. et al., 1996; Brustle O., Jones K.N, Learish R.D. et al.,1999; Finley M.F.A.,Devata S.,Huettner J.E.,1999). Как известно, пересадки пролиферирующих тотипотентных ЭСК в мозг не практикуются из-за риска малигнизации части клеток. Однако фракцию эмбриоидных телец с дифференцирующимися нейронами удавалось пересаживать в мозг животных без осложнений. После пересадки в мозг часть клеток трансформировалась в нестин+ популяции клеток ( Benniger Y., Marino S., Hardegger R. et al., 2000).

11. Получение нейронов из ЭСК

Уже в начале 90-х годов в печати появились первые протоколы наработки дифференцированных нейронов из ЭСК тератокарциномы (Yao M.,Bain G., GottliebD.L.,1995). Сперва незрелые клетки тератокарциномы размножали с помощью ростовых факторов в простой питательной среде с добавками. Затем клетки переводили в среду без ростовых факторов, в которую добавляли ретиноевую кислоту и В27 Neurobasal supplement. В новой среде селективно выживали только постмитотические нейробласты, а незрелые стволовые/прогениторные популяции погибали. В первых работах эффективность образования нейронов in vitro оставалась ниже 10 %. Однако эффективность лабораторного нейрогенеза можно значительно улучшить, если на первом этапе улучшить образование НСК из ЭСК. Сперва необходимо увеличить выход нестин+ клеток в культуре . Затем изолированную популяцию НСК размножали в селективной среде. Выход нейронов из высокоочишенной фракции НСК довели до 60-80%. В конце 90-х годов фирма BioLayton (Калифорния) оказалась первым частным собственником технологической линии с целью крупномасштабного выращивания нейронов человека по всем стандартам GМP. Из стандартного сырья стали готовить биотрансплантаты для лечения пациентов. Первоначально фирма купила университетский патент Пенсильванского университета (авторы - Virginia Lee, John Troyanovsky, No5792900), заявленный на способ изготовления нейротрансплантата в виде однородной популяции нейронов, полученных из плюрипотентных незрелых клеток эмбриональной тератокарциномы NT2N. Образование нейронов индуцировали добавлением сыворотки и ретиноевой кислоты под контролем следующих маркеров: нестин, NF-1, MAP-2C, alpha-internexin.Через 5-7 дней островки прикрепившихся незрелых клеток начинали синтезировать N-кадхерин и NCAM. Еще через три дня после добавления индукционной среды, состав которой запатентован, клетки образовали нейрофиламенты, увеличивали фосфорилирование компонентов цитоскелета и сигнальных белков. Еще через 10-13 дней культивирования 90-98% клеток приобретали фенотип нейробластов с характерными отростками. Примерно 4-5 нед уходило на созревание нейронов из ЭСК. Нейроны возникали не только из одиночных прикрепленных клеток, но и агрегатов ЭСК. Синхронно с появлением маркеров диффренцировки из клеток исчезал нестин. Более зрелые нейроны экспрессировали белок tau и MAP-2b. Согласно GLP-протоколу, до 95% клеток в культуре превращались в типичные нейроны с характерными отростками, электровозбудимой мембраной и секрецией медиаторов. Остальные незрелые примесные клетки высортировывали на поточном сортировщике клеток. Лабораторно полученные нейроны не ревертировали спонтанно к фенотипу тератокарциномы или незрелых клеток, не давали опухолей при введении в ткани животным. Лабораторно полученные нейроны фирмы BioLayton хорошо выживали после трансплантации в мозге животных-реципиентов. Часть клеток пролиферировала и встраивалась в локальные нейрональные сети (детали см. www.biolayton.com). На языке профиля мРНК рестрикционное созревание тератокарциномы NT-2 делилось на три этапа. (Przyborski S.A., Morton I.E., Wood A. et al., 2000). В первую фазу увеличивалось число нестин+ клеток, что совпадало с увеличением Notch-1 мРНК. Во вторую фазу роста мРНК NeuroD и снижения мРНК нестина происходило накопление пула прогениторных клеток. Фазу постмитотических зрелых нейронов верифицировали по накоплениею мРНК синаптофизина и энолазы и одновременному исчезновению мРНК NeuroD.

Пути дифференцировки нейробластов из ЭСК тератокарциномы прослеживали с помощью профиля экспрессии других генов. В случае дорзальных (чувствительных) нейронов первой появлялась мРНК гена Рах-7 после добавления ретиноевой кислоты. В случае вентральных нейронов первой детектировалась мРНК гена Рах-6. Появление клеток нервного гребня в культуре маркировали появлением мРНК генов Рах-7 и Erb3. Дальнейшее созревание сомато-мотонейронов маркировали экспрессией Islet-1, Islet-2, Lim-3, HB-9. Краниальные мотонейроны экспрессировали мРНК Islet-1, Islet-2, Phox-2b. Интернейроны экспрессировали мРНК Lim-1, Lim-2, Eng-1 (Renoncourt Y., Carroll P., Filippi P. et al., 1998).

Ключевым моментом созревания ДОПА-нейронов из ЭСК линии NT2 была экспрессия гена тирозингидроксилазы (ТГ). В культуре максимальное количество ТГ+ клеток удавалось получить с помощью трех индукторов : FGF-1,

страница 50
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66

Скачать книгу "Эмбриональные стволовые клетки" (12.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]


Химический каталог Rambler's Top100

Copyright © 2009
(18.08.2019)