медицинский каталог




Практикум по микробиологии

Автор Е.3.Теппер, В.К.Шильникова, Г.И.Переверзева

ирокого пользования. В лабораторной практике этот метод чаще применяют в упрощенной модификации О. Г. Шульгиной. Из тщательно отобранной средней почвенной пробы берут 5 г и вносят в эрленмейеровскую колбу емкостью 250 мл, содержащую 50 мл стерильной водопроводной воды.

Согласно Д. Г. Звягинцеву (см. стр. 147), навеску почвы следует предварительно растереть в стерильной агатовой или фарфоровой ступке с небольшим количеством стерильной воды. Для черноземов и темно-каштановых почв растирают навеску с 0,1 %-ным раст160

вором пирофосфата натрия. После встряхивания в течение 5 мин с водой-или раствором пирофосфата дают осесть грубым частицам (2—5 с), из подученной взвеси стерильной градуированной пипеткой берут 0,01 мл в переносят на хорошо обезжиренное предметное стекло. Одновременно с суспензией на стекло помещают каплю 0,1 % -ного раствора агара (хорошо отмытый агар готовят На дистиллированной воде). Агар и суспензию на стекле перемешивают и .стерильным покровным стеклом распределяют по трафарету на 4 см* (трафарет делают следующим образом: на миллиметровой бумаге тушью заштриховывают 4 см2 и бумагу приклеивают к предметному"стеклу с нижней стороны).

"Препарат подсушивают, фиксируют 96%-ным спиртом и красят карболовым эритрозином (от 30 мин до суток). При окрашивании стекла погружают в раствор эритрознна. Остаток красителя смывают опусканием стекла в воду тыльной стороной, затем препарат подсушивают и просматривают нод микроскопом с иммерсионной системой объектива.

Для получения более точных результатов подсчитывают число зародышей в 100 полях зрения и определяют среднее количество на одно поле зрения. Одновременно устанавливают площадь поля зрения (р), которое представляет собой площадь круга иг2. Диаметр поля зрения измеряют при помощи объектного микрометра. После определения площади поля зрения находят, сколько полей зрения размещается на площади

Если

?=20000.

мазка—400 мм2 (/'), для чего Р делят на р диаметр поля зрения равен 0,16 мм, площадь поля зреР .... 400 мы»

«ия 0,02 мм2, то

р ' '' 0,02 мм»

Среднее число клеток в иоле зрения умножают на 20 000 и устанавливают число клеток в 0,01 мл суспензии. Для определения количества их в 1 мл суспензии умножают полученное число на 100, а для определения

в 1 г абсолютно сухой почвы — на степень разведения и делят на навеску абсолютно сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы.

Использование метода прямого учета бактерий в почве показало, что в ней содержится в сотни и тысячи раз больше клеток микроорганизмов по сравнению с

II Тешир Е. 3. 141

тем, что удается учесть методом питательных пластин. Большой недостаток метода — невозможность установить число жизнеспособных зародышей. В какой-то мере ею можно устранить при использовании метода флуоресцентной микроскопии.

Определение общего количества бактерий в почве с использованием метода флуоресцентной микроскопии (в модификации Звягинцева), Метод основан на контрастной окраске почвенных частиц и клеток микроорганизмов в флуоресцентном микроскопе.

При окрашивании почвы раствором акридина оранжевого почвенные частицы в флуоресцентном микроскопе выглядят красными, а клетки микроорганизмов — зелеными. Метод дает возможность подсчитывать не только свободные клетки, но и клетки в микроколонии, адсорбированные на поверхности почвенных частиц и микроагрегатов, • а также • рассматривать вегетативные клетки, клетки в состоянии спор и частично дифференцировать живые и мертвые клетки. Водоросли и содержащие хлорофилл микроорганизмы рассматривают в флуоресцентном микроскопе без окрашивания почвенной суспензии, так как пигмент сам обладает интенсивной красной флуоресценцией.

Д. Г. Звягинцев (1966) рекомендует микроорганизмы в флуоресцентном микроскопе подсчитывать следующим образом.

Сначала готовят суспензию разведения 10-2, затем пипеткой отбирают пробы по 1 мл в 5—10 пробирок.

В каждую из этих пробирок добавляют по 1 мл раствора акридина оранжевого из следующих концентраций: 1:500; 1:1000; 1:2000; 1:4000; 1:8000; 1:16 000; 1:32 000. Для почв с большим количеством коллоидов применяют более концентрированные растворы акридина оранжевого, для остальных — более разбавленные. После определения концентрации красителя готовят еще более дробные его разведения и определяют оптимальную концентрацию акридина оранжевого.

Для многих почв (черноземные, темно-каштановые и др.) Д. Г. Звягинцев рекомендует растирать навеску и приготовлять суспензию с пирофосфатом натрия. При этом следует испытать 5%-, 1%- и 0,1%-ные концентрации.

Пирофосфат способствует диспергированию почвы И десорбции микроорганизмов, а также частичному затуханию красной флуоресценции; зеленые микробные клетки вырисовываются четче. В качестве тушителя применяют также фуксин Циля и диазоновый зеленый.

Подсчитывают микроорганизмы в специальных камерах глубиной 10—25 мкм и в счетных капиллярах Перфильева. Камеру Горяена для этой цели использовать нельзя.

Можно проводить подсчет в раздавленной капле; края покровного стекл

страница 53
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74

Скачать книгу "Практикум по микробиологии" (2.95Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]


Химический каталог Rambler's Top100

Copyright © 2009
(19.02.2019)