медицинский каталог




Практикум по микробиологии

Автор Е.3.Теппер, В.К.Шильникова, Г.И.Переверзева

и, в частности и денитри-фикаторов и азотфиксаторов.

Фиксация N2 микрофлорой при наличии достаточного количества источника- углерода начинается практически после полной утилизации нитратов и нитритов. Этот момент может быть зафиксирован по появлению в газовой фазе этилена. Использование в качестве источника углерода глюкозы позволяет дополнительно контролировать нитрогеназную активность по выделению Ш и некоторой убыли N2.

Принцип метода определения денитрифицирующей активности почвы состоит в том, что введение ацетилена в исходную атмосферу дает возможность фиксировать количество выделившейся закиси азота в процессе диссимиляции N03- - и N02~ (т. е. денитрификации). Накопление N20 прекращается с исчезновением нитратов и нитритов из субстрата, что совпадает с появлением этилена, свидетельствующего об азотфиксирующей активности микрофлоры. Анализ газовой фазы на указанные компоненты в динамике позволяет определить максимальное количество NjO, образовавшейся в опыте, и рассчитать по нему количество восстановленных до закиси азота нитратов и нитритов. Все необходимые газовые составляющие могут быть идентифицированы на одном детекторе.

Определение удобно проводить в стеклянных сосу174 дах, имеющих боковой отросток, перекрывающийся притертым стеклянным затвором, и отверстие сверху, которое после внесения в сосуд почвы, глюкозы (13,3 мг на 1 г почвы) и нитрата (0,5 мг KN03 на 1 г почвы) в виде растворов закрывается пробкой из силиконовой резины. Такая пробка позволяет производить многократный отбор проб газа без потери герметичности. При открытом затворе через боковой отросток с помощью вакуумного насоса, соединенного с манометром, эвакуируют атмосферный воздух и проводят 2—3-кратную промывку содержимого сосуда инертным газом, наполняя его газом с помощью шприца и затем откачивая газ через боковой отросток. Для этой цели, применяют Аг или Не, который соответственно используют в качестве основы экспериментальной газовой смеси.

Затем половицу сосудов заполняют газовой смесью с 1,5% С2Н2> а другую —с 10%-ным С2Н2. Большая концентрация С2Н2 оказывает большее тормозящее действие на утилизацию NjO микроорганизмами, что дает возможность надежно фиксировать максимум образовавшегося в процессе денитрификации N0 и позволяет подстраховать исследователя в том- случае, когда в вариантах с меньшим содержанием ацетилена он не будет уловлен.

Газовые смеси готовят в газовых смесителях (за 24 ч). Количество образовавшегося N20 определяют по калибровочным кривым. Определение всех газовых компонентов (GOj, N20, N2, Н2, QHs, С2Н*, С1Ц) расширяет возможности метода, позволяет наблюдать смену процессов, обусловленную активностью отдельных физиологических Трупп микроорганизмов (включая метано-образующне) н изучать воздействие на них отдельных факторов.

Г. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЗОТФИКСИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ

При определении азотфиксирующей активности чистых культур микроорганизмов, выделенных из почвы или других мест обитания, М. В. Федоров предлагает следующее: в эрленмейеровские колбы емкостью 300 мл наливают 100 мл питательной среды для азотобактера, содержащей 2% глюкозы. После стерилизации при давлении 0,5 атм. в течение 30 мин среду заражают суспен17S

зией чистой культуры микроорганизмов и ставят в термостат при температуре 30°С. Для контроля оставляют колбочки без заражения, Повторность ШИЛЕ минимум двукратная. По окончании опыта (через 15 или 30 суток) из контрольных и опытных колб берут соответствующий объем субстрата для определения остатка глюкозы в нем (по методу Бертрана или другим методом) и общего азота (по методу Кьельдяли).

Азотфиксирующую активность выражают в миллиграммах азота на 1 г использованной глюкозы. При высокой азотфиксирующей активности на 1 г углевода будет усваиваться около 15—20 мг атмосферного азота, а при низкой — 2—3 мг,

Нитрогеназный комплекс азотфиксирующих микроорганизмов способен восстанавливать ацетилен С2112 до этилена С2Н«. Оба указанных непредельных углеводорода легко идентифицируются с помощью газового хроматографа. Поскольку процессы восстановления молекулярного азота и ацетилена аналогичны, последний стал широко применяться для моделирования и изучения азотфиксации. Метод определении азотфиксирующей активности микроорганизмов по восстановлению С2Н2 в QH4* детально разработан Харди с соавторами (Hardy et al., 1968). Чувствительность данного метода позволяет обнаружить до 10*~12М этилена, она превосходит чувствительность масс-спектрометрического определения Nj1! в 10э раз, выше метода определения азота по Кьельдалю в 10е раз. Питательную среду с культурой помещают в 10-миллилитровые шприцы фирмы «Chira-па». Атмосферный воздух эвакуируют с помощью вакуумного насоса, соединенного со шприцем и манометром, и содержимое шприца (инокулят) трижды промывают аргоном (Аг). Затем шприцы заполняют газовой смесью Аг 1 2%С2Н2 (для анаэробов). Для аэробных микроорганизмов в газовую смесь вводят 02 (2—10%), После заполнения шприца газовой смесью иглу снимают и отверстие закрывают силиконовой пробкой, чер

страница 58
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74

Скачать книгу "Практикум по микробиологии" (2.95Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]


Химический каталог Rambler's Top100

Copyright © 2009
(25.08.2019)